Metode non viral lebih menguntungkan daripada metode viral. Keuntungan itu ialah produksi skala besar yang sederhana dan imunogenisitas sel inang yang rendah. Mulanya, tingkat transfeksi dan ekspresi gen yang rendah ialah kelemahan dari metode non viral. Namun perkembangan baru-baru ini dalam teknologi vector menghasilkan molekul dan teknik dengan efisiensi transfeksi mirip dengan virus.
Metode non virus dengan menggunakan bahan sebagai berikut:
a. DNA telanjang (naked DNA)
Metode paling sederhana dari transfeksi non viral ialah dengan menginjeksikan naked DNA ke intramuscular. Metode yang lain ialah pengobatan dengan plasmid dengan produk PCR naked. Naked DNA dapat juga dikirimkan ke sel dengancara elektroporasi dan menggunakan ``tembakan gen`` yang menembakkan DNA yang dibungkus partikel emas ke dalam sel menggunakan tekanan gas tinggi.
b. Oligonukleotida
Penggunaan oligonukleotida sintesis dalam terapi gen ialah untuk menginaktifkan gen yang terlibat dalam proses penyakit. Dalam hal ini dapat digunakan beberapa metode. Suatu strategi menggunakan antisense spesifik ke gen target untuk mengganggu transkripsi gen yang salah. Strategi lain dengan menggunakan molekul katalitik kecil yang disebut siRNA untuk melekatkan sekuens unik spesifik ke dalam transkrip mRNA dari gen yang salah, mengganggu translasi dari mRNA yang salah dan ekspresi gennya. Strategi lebih lanjut menggunakan oligodeoksinukleotida untai ganda sebagai umpan untuk faktor transkripsi yang dibutuhkan untuk mengaktifkan transkripsi dari gen target. Faktor transkripsi terikat ke umpan menggantikan promoter dari gen yang salah kemudian mengurangi transkripsi dari gen target sehingga mengurangu ekspresinya.
c. Lipopleks dan Polipleks
Untuk meningkatkan pengiriman DNA baru ke dalam sel, DNA harus dilindungi dari kerusakan dan pemasukkannya ke dalam sel harus difasilitasi. Untuk tujuan itu lipopleks dan polipleks diciptakan. Polipleks dan lipopleks memiliki kemampuan untuk melindungi DNA dari degradasi yang tidak diinginkan selama proses transfeksi.
DNA plasmid dapat dibungkus dengan lipid dalam struktur terorganisasi seperti misel atau lisosom. Ketika struktur terorganisasi itu dikomplekskan dengan DNA, kompleks itu disebut lipopleks. Ada tiga jenis lipid, yaitu anionic, netral dan kationik. Pada awalnya, lipid netral dan anionic digunakan untuk mengkonstruksi lipopleks untuk vector sintesis. Namun meskipun lipid netral dan anionic memiliki toksisitas rendah, cocok dengan cairan tubuh dan ada kemungkinan untuk mengadaptasikan mereka untuk menjadi jaringan spesifik, mereka sangat rumit dan memakan waktu lama untuk membuatnya. Karena itulah, perhatian kemudian ditujukan kepada lipid kationik.
Lipid kationik karena muatan positifnya maka sering dikomplekskan dengan DNA yang bermuatan negative. Karena muatan mereka maka mereka berinteraksi dengan membrane sel, endositosis dari lipopleks terjadi dan DNA dilepaskan ke dalam sitoplasma. Lipid kationik melindungi DNA dari degradasi oleh sel.
Penggunaan yang paling umum dari lipopleks ialah dalam transfer gen ke dalam sel kanker dimana gen yang diberikan mengaktifkan gen yang mengontrol penindas tumor dalam sel dan mengurangi aktifitas onkogen. Penelitian akhir-akhir ini menunjukkan bahwa lipopleks juga dapat digunakan untuk transfeksi sel epitel pernafasan. Sehingga dapat digunakan untuk pengobatan penyakit pernafasan genetic seperti cystic fibrosis.
Polimer kompleks dengan DNA disebut polipleks. Kebanyakn polipleks terdiri dari polimer kationik dan proses produksinya diatur dengan interaksi ionic. Perbedaan besar antara metode yang menggunakan aksi polipleks dengan metode yang menggunakan aksi lipopleks adalah polipleks tidak dapat melepaskan DNA mereka ke sitoplasma. Karena itu, co-transfeksi dengan agen endosome lytic (untuk melisis endosom yang dibuat selama endositosis dimana endositosis ialah proses dimana polipleks memasuki sel) seperti adenovirus inaktif harus terjadi. Polimer seperti polietilenimin, chitosan dan trimetilchitosan memiliki metode tersendiri untuk mengganggu endosom.
3. Metode Hibrid
Karena setiap metode dari transfer gen memiliki banyak kelemahan maka metode hybrid dikembangkan. Metode hybrid menggabungkan dua atau lebih teknik mentransfer gen. Contohnya, virosom yang merupakan gabungan dari lisosom dengan virus influenza atau HIV yang tidak diaktifkan. Visosom membuat transfer gen ke sel epitel pernafasan menjadi lebih efisien daripada metode lisosom saja atau metode viral saja. Metode lain melibatkan gabungan dari vector viral yang lain dengan lipid kationik atau virus penghibrid (www.en.wikipedia.org).
· Masalah Terapi Gen
Beberapa masalah dalam terapi gen meliputi:
a. Waktu hidup yang pendek dari gen terapi
Sebelum terapi gen menjadi pengobatan yang permanen untuk segala kondisi, DNA terapeutik yang dimasukkan ke dalam genom harus berfungsi dan sel yang mengandung DNA terapeutik harus hidup lama dan stabil. Masalh-masalah dengan penggabungan DNA terapeutik ke dalam genom dan pembelahan yang sangat cepat dari banyak sel mengakibatkan terpai gen tidak dapat bermanfaat untuk jangka waktu lama. Karena ini pasien mengalami berkali-kali terapi gen.
b. Respon imun
Obyek asing apapun yang dimasukkan ke dalam jaringan manusia akan diserang oleh sistem imun. Sistem imun yang membuat keefektifan terapi gen berkurang menjadi masalah yang penting.
c. Masalah dengan vektor virus
Virus yang banyak digunakan sebagai pembawa dalam terapi gen menghadirkan banyak masalah bagi pasien seperti toksisitas danrespon imun. Selalu ada kekhawatiran bahwa vektor virus dapat menyebabkan penyakit dalam tubuh pasien.
d. Kerusakan multigen
Terapi gen yang baik hanya menyebabkan mutasi pada satu gen tunggal. Namun pada banyak terapi gen, kerusakan multigen terjadi. Penyakit hati, tekanan darah tinggi, penyakit Alzheimer, artritis dan diabetes ialah penyakit yang disebabkan oleh efek penggabungan dari variasi banyak gen.
e. Kemungkinan memicu tumor (mutasi insersional)
Jika DNA digabungkan dalam tempat yang salah dalam genom, maka dapat memicu tumor. Ini pernah terjadi pada pengobatan klinis untuk pasien yang menderita X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID)
· Situs terapi gen
Pengobatan terapi gen baru-baru ini mentargetkan beberapa jaringan meliputi sel batang, endothelium, kulit, otot, paru-paru, syaraf dan jaringan janin.
a. Sel Batang (Stem cell)
Stem cell adalah sel yang tidak/belum terspesialisasi yang mempunyai 2 sifat:
1. Kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi sel lain (differentiate).
Dalam hal ini stem cell mampu berkembang menjadi berbagai jenis sel matang, misalnya sel saraf, sel otot jantung, sel otot rangka, sel pankreas, dan lain-lain.
2. Kemampuan untuk memperbaharui atau meregenerasi
dirinya sendiri (self-regenerate/self-renew). Dalam hal ini stem cell dapat membuat salinan sel yang persis sama dengan dirinya melalui pembelahan sel.
Stem cell (dalam hal ini hematopoietic stem cell) digunakan sebagai alat pembawa transgen ke dalam tubuh pasien, dan selanjutnya dapat dilacak jejaknya apakah stem cell ini berhasil mengekspresikan gen tertentu dalam tubuh pasien atau tidak. Dan karena stem cell mempunyai sifat self-renewing, maka pemberian pada terapi gen tidak perlu dilakukan berulang-ulang, selain itu hematopoietic stem cell juga dapat berdiferensiasi menjadi bermacam-macam sel, sehingga transgen tersebut dapat menetap di berbagai macam sel. (www.kalbe.co.id/.../153_12Dasarstemcelldanpotensiaplikasinya.html
b. Endothelium (Pintu gerbang ke aliran darah)
Secara genetic mengubah endothelium dapat mengsekresikan substansi yang benar yang dibutuhkan ke dalam aliran darah. Dalam penderita diabetes misalnya, mengubah endothelium dapat mengsekresikan insulin.
c. Kulit
Sel kulit tumbuh dengan baik di laboratorium. Gen manusia seperti gen yang mengkode hormone pertumbuhan manusia dapat dimasukkan ke dalam kulit manusia yang ditumbuhkan di kultur.
d. Otot
Sel otot rangka yang masih muda disebut myoblast. Myoblast dapat dimanipulasi karena:
- Myoblast dapat menerima gen asing
- Myoblast dapat mengsekresikan protein dalam jumlah banyak
- Myoblast mudah ditumbuhkan di kultur
- Myoblast diterima dalam tubuh ke dalam otot yang tidak muda.
e. Hati
Hati ialah fokus terapi gen yang paling penting karena hati mengkontrol banyak fungsi tubuh. Kemajuan terapi gen dengan situs hati lambat karena sel hati manusia (hepatocyte) sulit dikulturkan dan berubah secara genetik.
Penggunaan hati sebagai situs terapi gen dapat digunakan untuk mengobati familial hiperkolesterolemia (FH). Sel hati diubah secara genetika untuk memproduksi reseptor LDL yang lebih banyak. Metodenya meliputi pemindahan 15% hati, isolasi hepatocyte dan menginfeksi sel hati tersebut dengan vektor retrovirus ynag membawa gen reseptor LDL normal.
f. Paru-paru
Saluran pernafasan menjadi kandidat utama untuk terapi gen karena sel-selnya dapat dicapai secara langsung oleh semprotan aerosol, mengeliminasi kebutuhan untuk memindahkan, mengobati dan mengimplan sel lagi. Beberapa eksperimen pengobatan untuk cystic fibrosis ialah aerosol yang mengganti gen tak sempurna. Contohnya, adenovirus yang umumnya menyebabkan demam diubah secara genetik menjadi tidak menyebabkan bersin-bersin dan mengandung gen CFTR fungsional. Sekali dihirup, sel saluran pernafasan mengambil vektor dan memproduksi protein yang hilang atau mutan dalam cystic fibrosis.
g. Jaringan syaraf
Meskipun syaraf dapat mengambil dan mengekspresikan gen asing, tapi mereka bukan target ideal untuk terapi gen karena sel syaraf normal tidak membelah. Terapi gen dengan target jaringan syaraf contohnya ialah pengobatan penyakit Alzheimer, Huntington dan depresi.
h. Janin
Untuk banyak penyakit keturunan, pergerakan maju penyakit dapat diprediksi dan penyakit menjadi lebih buruk saat gejala mulai nampak. Terapi gen paling efektif ialah terapi gen yang dilakukan sebelum gejala penyakit muncul.
Janin lebih dapat menerima terapi gen daripada anak-anak dan orang dewasa. Jaringan janin biasanya belum dirusak oleh penyakit, respon imun belum ada dan tersedia lebih banyak stem cell untuk dimanipulasi.
Di manusia, terapi gen pada janin sangat membantu untuk mengobati penyakit yang gejalanya muncul sangat dini pada masa kanak-kanak, seperti cystic fibrosis dan penyakit penyimpanan liposomal (Lewis, Ricki, 1997).
DAFTAR PUSTAKA :
-
- Lewis, Ricki, 1997, Human Genetics Concepts AND Application 2nd edition, USA: Wm.C. Brown Publishers.
-www.kalbe.co.id/.../153_12Dasarstemcelldanpotensiaplikasinya.html
Tidak ada komentar:
Posting Komentar